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蛋白质分离技术
蛋白蛋白质的分离纯化有多类方法,如沉淀法(特别常用盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法)、膜分离法(超滤法、透析法
  蛋白质的分离纯化有多类方法,如沉淀法(特别常用盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法)、膜分离法(超滤法、透析法)、色谱法、离心分离法等。每类方法有其自己的特点和适用范围。如粗提常用沉淀法,精提就不会用沉淀法。这些方法中,应用最广的是色谱法。
   色谱法,在生化和医药行业叫层析。但中国化学会、中科院相关部门及有关期刊都规定要叫色谱。在国家有关色谱名词术语的国家标准中“chromatography”一词翻译成“色谱”。故在此我们将柱分离叫色谱。柱内的分离介质一般也叫填料、固定相。
   在蛋白质色谱纯化中最重要的是分离介质和色谱条件的选择。有些从事分离工作的人,拿到样品后常不知道怎么办。其实这两者的选择只要根据分离对象和每种色谱的分离机理来考虑,就可以自行设计分离方案。蛋白质分离介质的选择应从蛋白质分子结构入手考虑。与一般小分子的天然产物和合成化合物的分离纯化工作比起来,蛋白质的分离有许多特殊性。
   1.蛋白质分子的结构决定了其分离工作的方法选择。
   蛋白质分子量大,都在6KD以上,是由多个氨基酸按一定序列通过肽键组合成肽链,再由一个或多个肽链通过共价键和非共价键组合成有复杂三级、四级结构的蛋白质分子。蛋白质还可能与糖、脂及核酸结合得到结合蛋白,不同的结合蛋白在性质上会有差异。蛋白质的外形为球状和纤维状,其大小因其分子量不同差异很大。故可以用排阻色谱、超滤和膜法分离大小不同的蛋白质。
   蛋白质与氨基酸一样,会两性离解,在不同的pH下形成正离子或负离子,蛋白质也有等电点。在相同的pH下,不同的蛋白质表面带电情况不一样,故可以用离子交换色谱分离蛋白质。
   蛋白质的氨基酸残基会有一些苯基、烷基等疏水性基团,这些疏水侧链在水相中会尽可能避开水相而藏于蛋白质分子内部,形成蛋白质分子外部亲水性基团多,疏水性基团多在蛋白质裂隙内部的情况,在不同条件下蛋白质裂隙会有不同的伸展而暴露出内部的疏水基团。在同一个介质中,不同蛋白质表面的疏水性不同,可以用疏水相互作用色谱和反相色谱分离。
   生物大分子有一个特性,某些分子或基团对它们有特异性很强的吸附作用。这种作用只针对一种或一类目标物质。如抗体特异性吸附抗原,苯甲脒对含丝氨酸的蛋白质有吸附作用。这就是亲和色谱的应用原理, 一般的小分子是不会有这种特异性吸附作用的。
   2.要特别注意保持样品的生物活性。
   蛋白质有复杂的三级、四级结构,热、光和化学品会导致其理化性质改变和生理活性丧失,这叫失活。失活有可逆和不可逆两种。不可逆失活的蛋白质常是固体,不溶于水和溶剂,不再具有蛋白质原有的生理性质。可逆失活的蛋白质可用不同的复性方法恢复其原有的生理活性。
   蛋白质在选择和评价分离纯化的方法、介质和色谱条件时,不仅要注意样品的质量回收率,还特别要重视活性回收率。要保持样品的生物活性,在分离方法、填料、色谱条件和操作工艺上要注意。
   在排阻、离子交换、疏水和反相、亲和四类色谱中,反相色谱一般容易使样品失活,常用于定性、定量分析和氨基酸序列分析,不太用于制备;其他的色谱方法,只要条件选择合适,都可以得到高的活性回收率。
   3.使用的色谱介质要注意其合适的分子量适用范围。
   一般的介质都是多孔的,多孔介质的比表面有90%~95% 是在孔内。分离时充分利用孔内表面,柱容量才能大。所以要根据样品分子量选择具有合适的孔的介质。在排阻色谱中孔的大小用排阻极限表示;其他色谱用分子量适用范围表示,实际是其基质的排阻极限。
   常用的蛋白质分离介质是琼脂糖和葡聚糖系列。琼脂糖的分子量适用范围取决于制备时琼脂糖的浓度,大家熟悉的4B,糖的浓度是4%,适用6×10 4~2×10 7分子量;6B,糖的浓度是6%,适用1×10 4~4×10 6分子量。葡聚糖系列的分离范围要看产品说明书,从几千到上千万不等。
   常用的硅胶系列孔径有用于小分子的6~12nm ;有用于一定分子量蛋白质的30 、 50、100nm。
   4. 生物大分子有不同于小分子的色谱特性。
   包括蛋白质在内的生物大分子有一些特别的色谱性质。
   在梯度洗脱的色谱,如反相色谱、疏水色谱、离子交换中,强洗脱剂的浓度对保留值(容量因子)作图有明显的突跃。而有机小分子没有此突跃。在蛋白质分离的许多问题可由此得到解释。
   5.紫外检测器检测波长固定在280nm和220nm 。
   280nm是检测蛋白质中的苯基,220nm是检测肽键。蛋白质检测实际常在选用280nm 检测波长。
   蛋白质分离介质选择要同时考虑两方面,一是配基,也就是选择色谱模式;二是选择基质,包括基质的种类和排阻极限的选择。
   根据目标产品与杂质的性质差异选择介质是介质选择的主要依据。选择了介质也就是选择了分离模式。
   目标产品与杂质在分子大小、等电点pI、不失活或可逆失活条件下的疏水性、与亲和配基的作用四种性质上的差异是介质选择的主要依据之一。产品与杂质某方面的性质有大的差异,就可用来做为分离方法选择的依据。目标产品与杂质分子大小差异大可用凝胶色谱分离;等电点pI差异大可用离子交换色谱分离;不失活或可逆失活条件下的疏水性差异大可用疏水色谱分离;与某个亲和配基有特异作用的可用亲和色谱分离。
   在凝胶色谱、离子交换、疏水和反相、亲和类色谱中,反相色谱一般容易使样品失活,常用于定性、定量分析和氨基酸序列分析,不太用于制备;其他的色谱方法,只要条件选择合适,都可以得到高的活性回收率,可以用于制备分离。
   基质主要有3大类:聚多糖,如交联琼脂糖、葡聚糖基质;硅胶和多孔玻璃;有机聚合物(聚苯乙烯等)。
   由于目标产品限定在蛋白质,分子量比较大,用于小分子的小孔填料肯定不能用。因为,多孔填料的总的表面积,有90~95%是在孔内,球型填料的球面上的面积只占有5~10%。小孔填料的柱容量太小。
   大孔硅胶和多孔玻璃,与蛋白质生物相容性差,大孔硅胶价格贵,表面活性基团少,制备的填料会残留酸性的硅羟基,造成非特异性吸附。大孔有机聚合物疏水性强,与蛋白质生物相容性太差,不作亲水性处理无法用于蛋白质分离。
   交联琼脂糖、葡聚糖基质是最适合用于蛋白质分离的基质材料,这两类材料生物相容性好,无非特异性吸附,表面有大量羟基,可用于连接配基,制得各种填料。
   琼脂糖微球及其交联后的产品一般叫4B、CL4B、4FF、6B、CL6B、6FF,这些产品再键合上不同基团得到离子交换、疏水、亲和色谱填料。4B、CL4B、4FF制备时的糖浓度为4%,排阻极限为6万~2000万。6B、CL6B、6FF制备时的糖浓度为6% ,排阻极限为1万 ~400万。4B、6B耐压低;CL4B、CL6B耐压稍高一点,仍很低;4FF、6FF耐压较高,使用压力可到0.15或0.3MPa。
   葡聚糖是线形结构,用环氧氯丙烷交联成球。因糖浓度和交联度不同,得到不同排阻极限的微球。葡聚糖微球排阻极限范围小些,在使用时不同条件下柱体积会有较大的变化,已逐渐较少用于离子交换、疏水、亲和色谱,较多用于凝胶色谱。
些,在使用时不同条件下柱体积会有较大的变化,已逐渐较少用于离子交换、疏水、亲和色谱,较多用于凝胶色谱。质的分离纯化有多类方法,如沉淀法(特别常用盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法)、膜分离法(超滤法、透析法
 
)、色谱法、离心分离法等。每类方法有其自己的特点和适用范围。如粗提常用沉淀法,精提就不会用沉淀法。这些方法中,应用
 
最广的是色谱法。
 
  色谱法,在生化和医药行业叫层析。但中国化学会、中科院相关部门及有关期刊都规定要叫色谱。在国家有关色谱名词术语的
 
国家标准中“chromatography”一词翻译成“色谱”。故在此我们将柱分离叫色谱。柱内的分离介质一般也叫填料、固定相。
 
  在蛋白质色谱纯化中最重要的是分离介质和色谱条件的选择。有些从事分离工作的人,拿到样品后常不知道怎么办。其实这两
 
者的选择只要根据分离对象和每种色谱的分离机理来考虑,就可以自行设计分离方案。蛋白质分离介质的选择应从蛋白质分子结构
 
入手考虑。与一般小分子的天然产物和合成化合物的分离纯化工作比起来,蛋白质的分离有许多特殊性。
 
  1.蛋白质分子的结构决定了其分离工作的方法选择。
 
  蛋白质分子量大,都在6KD以上,是由多个氨基酸按一定序列通过肽键组合成肽链,再由一个或多个肽链通过共价键和非共价键
 
组合成有复杂三级、四级结构的蛋白质分子。蛋白质还可能与糖、脂及核酸结合得到结合蛋白,不同的结合蛋白在性质上会有差异
 
。蛋白质的外形为球状和纤维状,其大小因其分子量不同差异很大。故可以用排阻色谱、超滤和膜法分离大小不同的蛋白质。
 
  蛋白质与氨基酸一样,会两性离解,在不同的pH下形成正离子或负离子,蛋白质也有等电点。在相同的pH下,不同的蛋白质表
 
面带电情况不一样,故可以用离子交换色谱分离蛋白质。
 
  蛋白质的氨基酸残基会有一些苯基、烷基等疏水性基团,这些疏水侧链在水相中会尽可能避开水相而藏于蛋白质分子内部,形
 
成蛋白质分子外部亲水性基团多,疏水性基团多在蛋白质裂隙内部的情况,在不同条件下蛋白质裂隙会有不同的伸展而暴露出内部
 
的疏水基团。在同一个介质中,不同蛋白质表面的疏水性不同,可以用疏水相互作用色谱和反相色谱分离。
 
  生物大分子有一个特性,某些分子或基团对它们有特异性很强的吸附作用。这种作用只针对一种或一类目标物质。如抗体特异
 
性吸附抗原,苯甲脒对含丝氨酸的蛋白质有吸附作用。这就是亲和色谱的应用原理, 一般的小分子是不会有这种特异性吸附作用的
 
 
  2.要特别注意保持样品的生物活性。
 
  蛋白质有复杂的三级、四级结构,热、光和化学品会导致其理化性质改变和生理活性丧失,这叫失活。失活有可逆和不可逆两
 
种。不可逆失活的蛋白质常是固体,不溶于水和溶剂,不再具有蛋白质原有的生理性质。可逆失活的蛋白质可用不同的复性方法恢
 
复其原有的生理活性。
 
  蛋白质在选择和评价分离纯化的方法、介质和色谱条件时,不仅要注意样品的质量回收率,还特别要重视活性回收率。要保持
 
样品的生物活性,在分离方法、填料、色谱条件和操作工艺上要注意。
 
  在排阻、离子交换、疏水和反相、亲和四类色谱中,反相色谱一般容易使样品失活,常用于定性、定量分析和氨基酸序列分析
 
,不太用于制备;其他的色谱方法,只要条件选择合适,都可以得到高的活性回收率。
 
  3.使用的色谱介质要注意其合适的分子量适用范围。
 
  一般的介质都是多孔的,多孔介质的比表面有90%~95% 是在孔内。分离时充分利用孔内表面,柱容量才能大。所以要根据样品
 
分子量选择具有合适的孔的介质。在排阻色谱中孔的大小用排阻极限表示;其他色谱用分子量适用范围表示,实际是其基质的排阻
 
极限。
 
  常用的蛋白质分离介质是琼脂糖和葡聚糖系列。琼脂糖的分子量适用范围取决于制备时琼脂糖的浓度,大家熟悉的4B,糖的浓
 
度是4%,适用6×10 4~2×10 7分子量;6B,糖的浓度是6%,适用1×10 4~4×10 6分子量。葡聚糖系列的分离范围要看产品说明书
 
,从几千到上千万不等。
 
  常用的硅胶系列孔径有用于小分子的6~12nm ;有用于一定分子量蛋白质的30 、 50、100nm。
 
  4. 生物大分子有不同于小分子的色谱特性。
 
  包括蛋白质在内的生物大分子有一些特别的色谱性质。
 
  在梯度洗脱的色谱,如反相色谱、疏水色谱、离子交换中,强洗脱剂的浓度对保留值(容量因子)作图有明显的突跃。而有机
 
小分子没有此突跃。在蛋白质分离的许多问题可由此得到解释。
 
  5.紫外检测器检测波长固定在280nm和220nm 。
 
  280nm是检测蛋白质中的苯基,220nm是检测肽键。蛋白质检测实际常在选用280nm 检测波长。
 
  蛋白质分离介质选择要同时考虑两方面,一是配基,也就是选择色谱模式;二是选择基质,包括基质的种类和排阻极限的选择
 
 
  根据目标产品与杂质的性质差异选择介质是介质选择的主要依据。选择了介质也就是选择了分离模式。
 
  目标产品与杂质在分子大小、等电点pI、不失活或可逆失活条件下的疏水性、与亲和配基的作用四种性质上的差异是介质选择
 
的主要依据之一。产品与杂质某方面的性质有大的差异,就可用来做为分离方法选择的依据。目标产品与杂质分子大小差异大可用
 
凝胶色谱分离;等电点pI差异大可用离子交换色谱分离;不失活或可逆失活条件下的疏水性差异大可用疏水色谱分离;与某个亲和
 
配基有特异作用的可用亲和色谱分离。
 
  在凝胶色谱、离子交换、疏水和反相、亲和类色谱中,反相色谱一般容易使样品失活,常用于定性、定量分析和氨基酸序列分
 
析,不太用于制备;其他的色谱方法,只要条件选择合适,都可以得到高的活性回收率,可以用于制备分离。
 
  基质主要有3大类:聚多糖,如交联琼脂糖、葡聚糖基质;硅胶和多孔玻璃;有机聚合物(聚苯乙烯等)。
 
  由于目标产品限定在蛋白质,分子量比较大,用于小分子的小孔填料肯定不能用。因为,多孔填料的总的表面积,有90~95%是
 
在孔内,球型填料的球面上的面积只占有5~10%。小孔填料的柱容量太小。
 
  大孔硅胶和多孔玻璃,与蛋白质生物相容性差,大孔硅胶价格贵,表面活性基团少,制备的填料会残留酸性的硅羟基,造成非
 
特异性吸附。大孔有机聚合物疏水性强,与蛋白质生物相容性太差,不作亲水性处理无法用于蛋白质分离。
 
  交联琼脂糖、葡聚糖基质是最适合用于蛋白质分离的基质材料,这两类材料生物相容性好,无非特异性吸附,表面有大量羟基
 
,可用于连接配基,制得各种填料。
 
  琼脂糖微球及其交联后的产品一般叫4B、CL4B、4FF、6B、CL6B、6FF,这些产品再键合上不同基团得到离子交换、疏水、亲和
 
色谱填料。4B、CL4B、4FF制备时的糖浓度为4%,排阻极限为6万~2000万。6B、CL6B、6FF制备时的糖浓度为6% ,排阻极限为1万 
 
~400万。4B、6B耐压低;CL4B、CL6B耐压稍高一点,仍很低;4FF、6FF耐压较高,使用压力可到0.15或0.3MPa。
 
  葡聚糖是线形结构,用环氧氯丙烷交联成球。因糖浓度和交联度不同,得到不同排阻极限的微球。葡聚糖微球排阻极限范围小
 
些,在使用时不同条件下柱体积会有较大的变化,已逐渐较少用于离子交换、疏水、亲和色谱,较多用于凝胶色谱。
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