重要的病重要的病毒类疫苗的生产工艺

 

一、甲型肝炎减毒活疫苗

  甲型肝炎的病原体是甲型肝炎病毒(hepatitis A vlrius，HAV)，1978年用感染HAV绒猴肝内复制的病毒经纯化、灭活后制成试验灭活甲型肝炎疫苗(inactivated hepatitis A vaccine )，简称甲肝疫苗，绒猴试验证明有保护作用。1979年在细胞培养中分离、培养成功HAV。野毒株在细胞培养中生长困难，驯化毒株繁殖缓慢且病毒滴度低，不引起细胞病变，成熟颗粒不释放到培养液中。20世纪80年代后期我国毛江森等研制成甲型肝炎减毒活疫苗，该疫苗生产中未经纯化加工。同时国外使用细胞培养来源的病毒材料研制了纯化的灭活甲肝疫苗，如史克必成的贺福立适(Hvarix)和默沙东的vaqta等。灭活甲肝疫苗由15S和70s两种颗粒组成，前者是完整的病毒体，后者则为自然的空心壳体，二者抗原性一致，空心颗粒是灭活疫苗中免疫原性物质的主要成分。20世纪末21世纪初国内也有科兴公司和医学生物所在开发纯化的灭活甲肝疫苗，前者已投入市场。

  纯化甲肝疫苗的生产工艺基本相似。通过细胞培养、接种已经过连续传代的HAV适应株毒种，进一步培养扩增病毒，收获细胞释放病毒颗粒。经过超滤、离子交换层析或分级离心等纯化加工，以甲醛灭括，制成疫苗原液。进一步加工可包括吸附佐剂等。

  制备甲肝疫苗所用的毒株均为在细胞培养中连续传代过的HAV适应株，CR326、HMl75、GBM、KRM003及CLF等。所用细胞多为传代细胞，如人二倍体细胞MRC-5、HEL，人胚肾细胞HEK，恒河猴胚肾细胞FRhK等，亦有使用非洲绿猴肾原代细胞的情况。

  史克必成的贺福立适甲肝疫苗采用HMl75株毒种，接种MRC-5细胞，培养后裂解以细胞收获病毒。病毒收获液经过除菌过滤，再通过超滤和柱层析工艺浓缩和提纯HAV。向纯化病毒里加入终浓度为250 μg/ml的甲醛，于37℃条件下灭活15天。灭活后的纯化病毒吸附Al(OH)3佐剂，加人终浓度为5 mg/ml的苯氧基乙醇(phenoxyethanol)作为防腐剂，按酶标法检测活性单位(Eu)稀释配制成720 Eu/ml和1440 Eu/ml两种浓度，每剂分装为360 Eu/0.5ml和720 Eu/0.5ml两种规格的成品。

  默沙东的Vaqta甲肝疫苗所用生产毒种是CR326F株，也采用MRC-5株人二倍体细胞培养，收获后先以有机溶剂萃取，再用聚乙二醇沉淀方法浓缩萃取物，浓缩产物经柱层析纯化，加人终浓度为100 μg/ml的甲醛，置37℃条件下灭活20天。已灭活后纯化病毒吸附Al(OH)3佐剂，不加任何防腐剂，按厂家自定义的标准单位(u)稀释配制成50 u/ml浓度，每荆分装为25 u/0 5 ml和50 u/ml两种规格的成品。

 

二、脊髓灰质炎减毒活疫苗

1．简介   

  脊髓灰质炎是由脊髓灰质炎病毒(polio virus)侵蚀中枢神经系统引起的、传播广泛且危害极大的急性传染病，脊髓灰质炎病毒造成脊髓前角灰白质区尤其是灰质区的特异性病变，临床上引起肢体肌肉松弛性麻痹，多发生于小儿。1909年发现脊髓灰质炎病毒后的40年中，疫苗研究进展缓慢，至该病毒能在非神经组织细胞中培养后，疫苗研制速度加快。1952～1953年Salk用猴睾丸或肾组织培养3个型的病毒获得成功，后制成灭活疫苗。随后Sabin研制成功碱毒活疫苗。国外现有纯化灭活脊髓灰质炎疫苗(inactivated polio vaccine，IPV)注射剂。我国现生产人二倍体细胞减毒活疫苗(固体糖丸剂型)和猴肾细胞脊髓灰质炎减毒活疫苗(液体剂型)两种口服疫苗(oral polio vaccine，OPV)，未经过纯化加工，均为三价疫苗。

2．生产工艺

  纯化的灭活脊髓灰质炎注射疫苗的生产毒种都为有毒株，Ⅰ型有Mahoney和Brunenders株，Ⅱ、Ⅲ型为MEF-l株和Saukett株。所用细胞多为Vero细胞，也有用MRC-5细胞者。

用微载体珠在各个l000 L培养罐中扩增基质细胞数目约为1.5×1012个/罐，每罐接种一型生产毒种，37℃培养3～4天，病毒复制过程中裂解细胞释放到培养液里。收获培养上清液，用0.2μm滤膜过滤澄清处理，超滤浓缩500倍至2 L，用柱层析技术去除细胞杂蛋白和DNA等杂质，获得1 5 L纯化病毒悬液。除菌过滤后加入1:4000甲醛，37℃灭活6天，过滤除去聚合团块。配型调整三型比例后分装为成品。

国内医科院医学生物所也进行了纯化脊髓灰质炎疫苗生产工艺的研究。其呲毒种接种单层Vero细胞，33℃培养30～48 h后收获病毒液。用0 6 μm和0.9μm孔径的筒式滤器串联过滤澄清病毒液。用1 0万分子量孔径PTHK滤膜超滤器将澄清病毒液浓缩100～200倍，病毒滴度增大，感染性回收率为85.6％。以具有分子筛和离子交换双重功能的Q-SepharoseFF凝胶柱对病毒浓缩液进一步层析纯化，层析柱先用40 mmo/L的PBS(PH=7)漂洗，病毒浓缩液上柱后，分别用40 mmol/L。的PBS(pH=7)和l mmol/L的NaCI洗脱，分部收集病毒富集峰，此步病毒感染性回收率可达100％，Vero细胞残留DNA可被除去。

 

三、流行性感冒疫苗

1．简介

  流行性感冒是由流感病毒(influenza virus)引发的急性呼吸道传染病。根据核蛋白（NP）和基质蛋白（M）免疫原性不同可将流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，甲型流感病毒是引起人类流感在全球流行的最重要的病原体，乙型流感病毒一般呈局部流行或小流行，丙型流感病毒仅引起散发流行。流感病毒毒粒表面有3种结构蛋白质，即HA(血凝素)、NA(神经氨酸酶)和M2，甲型流感病毒根据HA和NA免疫原性的不同，分为若干亚型（乙型、丙型流感病毒至今未发现亚型），目前已鉴定出15个HA亚型（H1～H15），9个NA亚型（N1～N9）。甲型流感病毒容易发生变异，主要是HA和NA的免疫原性易发生变异，HA变异最快，自20世纪以来，在人类流行的只有H1、H2、H3和N1、N2几个亚型。1937年鸡胚培养流感病毒获得成功，l941年早期粗制流感灭活疫苗问世，以后有冷适应株减毒活疫苗应用。现今流行性感冒疫苗(influenza vaccine)主要有3类，即灭活全病毒颗粒悬液疫苗、以物化方法部分或全部裂解病毒颗粒的裂解疫苗及主要由HA和NA抗原制成的亚单位疫苗，其中灭活疫苗是当前最常用的流感病毒疫苗。

2．生产工艺

  因流感病毒易发生抗原变异，世界卫生组织(WHO)发起每年进行流感病毒全球范围监测并发布当年和预测来年流行毒株。我国流感中心据此提供相似株供每年生产使用。WHO流感疫苗规程提倡生产含有至少一种或一种以上甲型病毒、一种乙型病毒株的多价流感疫苗(一般为三价)。毒株均用鸡胚胎培养。

  早期粗制流感灭活疫苗是用含流感毒粒的鸡胚胎尿囊液，进行红细胞吸附和释放的有月纯化，以甲醛灭活制戒，接种后局部和全身反应很强。后采用超速离心和层析技术提纯获得纯度提高的全毒粒疫苗，但儿童使用仍可出现不良反应。以3-N-丁基磷酸盐、聚山梨酸80酯、脱氧胆酸盐、Triton X--100和Triton N-101等裂解毒粒制成的裂解苗使不良反应大为降低。

  某灭活流感疫苗工艺流程是将病毒毒种稀释后，接种于无特殊病原体的9～10日龄鸡胚胎尿囊腔中，32～34℃培养48～80 h，收取高滴度的尿囊液和羊水，合并单价病毒收获液。各单价流感病毒收获液以蔗糖为介质进行速率区带超速离心纯化毒粒。所用蔗糖梯度液浓度为30％～55％，25000 r/min，15℃离心8 h后，分步收集合并HA高滴度峰，此过程可去除尿囊液和羊水大部杂质成分并浓缩毒粒。按1:600O比例加入β-丙烯内酯作为灭活剂，20℃灭活72 h。用超滤技术脱去蔗糖，经除菌过滤配型后分装为成品。除β-丙烯内酯，甲醛也是常用的灭活剂。

  再以流感感裂解疫苗为例，将冻干病毒毒种稀释后，接种于无特殊病原体的9～10日龄鸡胚胎尿囊腔中，35℃培养48 h冷胚，收集合并尿囊液。以10000分子量的超滤膜滤器超滤浓缩后，经Sepharose 4FF凝胶柱层析纯化，分步收集毒粒富集液。按血凝效价l：25600稀释，加入终浓度1.0％的Triton X-100裂解90 min，再经蔗糖梯度超速离心纯化，分步收集血凝效价l:160以上的抗原峰。合并后超滤除掉蔗糖，稀释并配型。

  裂解疫苗和亚甲位疫苗虽可减少不良反，但免疫原性不如全毒粒疫苗，促使人们开展了各类佐剂的应用研究。

 

四、流行性乙型脑炎疫苗

1．简介

  流行性乙型脑炎(己脑)是由乙型脑炎病毒引起的人畜共患中枢神经系统传染病，该病毒首先由日本学者于1935年从脑炎死亡者脑组织中分离得到，故国际上又称为日本脑炎病毒。病毒的抗原性由三种结构蛋白和非结构蛋白构成。80世纪30～40年代日本、美国制备了鼠脑灭活疫苗，1946年Warren和Koproski等制成鸡胚灭活疫苗，但使用效果并不满意。我国现有两种乙脑疫苗，是用P3株和SAl4-14-2株乙脑病毒毒种接种原代地鼠肾细胞培养制备的灭活疫苗和减毒活疫苗，并与国外同步研制纯化乙型脑炎疫苗(japanese encephalitis vaccine inactived)。

2．生产工艺

  日本生广鼠脑提纯乙脑灭活疫苗过去使用中山(Nakayama)株，1989年起改用北京l(Bejing 1)株，即P1株，在小白鼠脑中培养。我同开发中的vero细胞(非洲绿猴肾细胞)乙脑疫苗采用P3株，国外有用SA14-14-2株研制纯化乙脑疫苗的。

  鼠脑提纯乙脑灭活疫苗生产工艺是将P1株毒种接种小白鼠脑腔，待小白鼠出现典型发病症状后，收取鼠脑组织，脑组织经过匀浆和澄清处理后，加入鱼精蛋白用以除去核酸，加入终浓度为O.6％的甲醛4℃冷灭活50～60天，超滤浓缩，用饱和(NH4)2SO4沉淀，3000 r/min离心50 min后弃沉淀，上清液用40%的蔗糖垫进行超速区带离心，19000 r/min离心13 h，收集纯化病毒。以磷酸盐缓冲液透析除糖，加人终浓度分别为0.009％、0.0005％的硫柳汞和吐温-80，除菌过滤，冻于为成品。

  Vero细胞纯化乙脑疫苗制造所使用毒种是P3株病毒，以Vero细胞为基质，可用15 L转瓶、5 L或50 L微载体生物反应器培养，毒种接种Vero细胞培养3天后开始收获病毒，每2天收获1次，可收获4～5次。病毒收获液先用甲醛灭活，过滤澄清后再用超滤技术浓缩10～20倍，用硫酸鱼精蛋白处理，去除残余DNA，得到粗制纯化产物。进一步精制提纯有两条技术路线：①蔗糖速率区带超速离心法。采用日立58-P-72D型超速离心机，配以RPZ-35T区带转头，以36％～60％蔗糖为介质，对粗制纯化产物进行速率区带超速离心分离，以23000 r/min转速离心4 h后，收集位于38％浓度蔗糖区带的病毒，超滤除糖后除菌过滤得到纯化乙脑疫苗原液。②凝胶层析法。使用全自动凝胶层析系统，将粗制纯化产物通过Sepharose CL-6B凝胶层析柱去除大部分杂蛋白，超滤浓缩，再用装填Sephacryl S-500HR介质的层析柱去除大于病毒的杂质和残留的小分子杂蛋白，除菌过滤后即为纯化乙脑疫苗原液。疫苗原液中加入保护剂分装冻干制备出成品。

 

五、狂犬疫苗

1．简介

  狂凡病是由狂犬病毒引起人兽共患疾病。国外早期的狂犬病疫苗(rabies vaccine)为神经组织培养疫苗。20世纪60年代始用细胞为基质制各疫苗，主要有人二倍体细胞疫苗(HDCV)、原代地鼠肾细胞狂犬病疫苗(PHKCV)、精制鸡胚细胞狂犬病疫苗(PCECV)和提纯的Vero细胞狂犬病疫苗(PVRV)等。我国早期生产羊脑制备的经石炭酸灭活的疫苗(也曾制备乙醚火活疫苗)，1980年开始应用组织培养法制造纯化狂犬病疫苗（rabies purified vaccine），现有原代地鼠肾细胞狂犬病疫苗和Vero细胞狂犬病纯化疫苗。

2．生产工艺

 （1）几种代表性狂犬病疫苗生产工艺

  ①人二倍体细胞疫苗(HDCV)   这种疫苗为美国Wistar研究所首创，用人二倍体细胞WI-38株适应和培养病毒。用磷酸丁三酯灭活病毒，过滤浓缩后制备疫苗。以后由法国Meieux研究所用MRC--5人二倍体细胞培养病毒，用l:4 000β-丙烯内酯灭活病毒，浓缩后制成冻干疫苗。这种疫苗人体接种观察后证明接种后副反应轻，免疫效果好，目前公认可以作为新发展疫苗的标准对照疫苗。 

  ② 原代地鼠肾细胞狂犬病疫苗(PHKCV)   前苏联用Vnukovo-32株毒种在原代地鼠肾细胞(PHKC)培养，用第33代～第178代病毒制备成主毒种和生产用毒种。感染细胞培养液经紫外光照射灭活后制成两种灭活疫苗，一种是未经浓缩纯化的原制疫苗，一种是经浓缩纯化的疫苗。PHKCV注射后的副反应轻。

  ③提纯的Vero细胞狂犬病疫苗(PVRV)   法国Memux研究所于1985年研究成功Vero细胞培养生产的狂犬病疫苗。疫苗经超滤浓缩，蔗糖密度梯度离心纯化，β-丙烯内酯灭活制成冻干疫苗。因伴随浓缩过程疫苗的异源小牛血清蛋白相应增加，导致不良反应的加重和增多。

  为了进一步减少纯化PVRV的副反应，Paster  Merieux Connaught厂新近又改用柱层析技术纯化疫苗，并在生产过程中将人白蛋自在加入β-丙烯内酯前去除掉，制成一种新的层析纯化Vero细胞生产狂犬病疫苗(CPRV)。这种疫苗经与现有的PVRV进行比较，副反应少同时又具有高免疫原性。

（2）主要纯化工艺

  大规模精制地鼠肾细胞和Vero细胞狂犬病纯化疫苗均以超滤法浓缩病毒培养液，然后采用层析和区带离心等技术纯化狂犬病毒。

  ①乙酸锌和Sepharose 4FF柱层析   狂犬病毒固定毒株接种基质细胞，培养后收获病毒培养液。所收获病毒培养液灭活后，用0.1～1.0 mol/L乙酸锌沉淀，弃上清液。乙酸锌沉淀后用EDTA溶液溶解，离心超滤浓缩即为柱层析料液，该料液经Sepharose 4FF柱层析，用紫外监测仪收集第一峰，可获得效价较高的病毒原液。稀释后加人佐剂和人血清白蛋白，制备成精制疫苗半成品。

  ②DEAE -Sepharose 4FF CL-6B离子交换层析   将浓缩的病毒原液100 ml，经0.01 mol/L pH7.2 PBS平衡柱透析两次后，选用介质DEAE-Sepharose CI-6B进行层析。上柱后分别用0.01 mol PB+0.15 mol NaCI、0 01 mol PB+0.03 mol NaCI及0.01 mol PB+0.05mol NaCI溶液洗脱，经紫外监测仪检测A280，分步收集蛋白质峰。取样后用ELISA法检测样品抗原活性，并将ELISA检测阳性样品合并，测定残余牛血清白蛋白含量、蛋白质含量和ELISA效价，并按最终含量加入0。6 mg/ml的Al(OH)3溶液和0.5％人白蛋白后进行效力试验和安全试验。

  ③Sephaery 1S-200 HR分子筛选层析法   将浓缩的病毒原液10 ml，经0.01 mol/L pH 7.2 PBS平衡柱透析两次后，选用介质Sephaery 1S-200 HR进行层析。上柱后分别用0.0l mol PBS+0.15 mol NaCl进行溶液洗脱，经紫外监测仪检测A280，分步收集蛋白质峰并进行各项检测。

  ④二次蔗糖等密度区带离心法   将病毒原液30倍浓缩后经1 000g离心20 min后取上清,按1/50加入pH 5.0，l mol Zn(Ac)2溶液，混匀后调至pH6.7～6.9，4℃放置20 min，1 000g离心40 min后取沉淀，TNE中4℃透析过夜，上述产物经第一次蔗糖等密度区带离心(梯度介质为10％～60％蔗糖溶液，50000g、l5 h)后分步收集弗进行各项检测。

这几种方法制成的地鼠肾细胞和Vero细胞狂犬病纯化疫苗,其效力、牛血清含量及安全试验等指标均符台WHO规程的要求。

 

六、肾综合征出血热原代地鼠肾细胞灭活疫苗

1．简介

  肾综合征出血热(epidemic haemorrhagic fever wlth renal syndrone，HFRS)是由布尼亚病毒科、汉坦病毒(Hantavirus，HV)属中的几种病毒引起的自然疫源性疾病，分布于亚、欧、非洲和美洲32个国家和地区。1978年李镐汪等首次分离到朝鲜出血热(KHF)病毒，1981年我国用非疫区黑线姬鼠及人肺癌传代细胞A549也分离到流行性出血热(EHF)病毒，将该病毒适应到VeroE--6细胞，为研制人用疫苗开创了新的前景。迄今国内外已初步研制出3类HFRS疫苗――肾综台征出血热原代地鼠肾细胞灭活疫苗(haemorrhagic fever wlth renal syndrome vaccine)，即纯化鼠脑灭活疫苗、两种细胞(地鼠肾细胞及沙鼠肾细胞)和基因工程重组痘苗载体活疫苗。

2．生产工艺

 （1）乳鼠脑肾综合征出血热纯化疫苗

  国内I型肾综合征出血热纯化疫苗生产采用LR1株毒种，接种1～3日龄乳鼠脑。选择6～9日龄发病典型的乳鼠，无菌取脑组织，经反复冻融使病毒充分释放。加磷酸缓冲液制成病毒悬液。低速离心后取上清液，加入适量鱼精蛋白，再低速离心后取上清被，加入1:4 000 的β-丙内酯于4℃灭活2天。以蔗糖速率区带离心法离心，分部收取糖膜蛋白G1、G2和核壳蛋白NP 。经凝胶层析脱糖纯化和除菌过滤后即为原液，以后加人防腐剂、稳定剂和佐剂分装出成品。

 （2）地鼠肾细胞肾综合征出血热灭活痘苗

  采用地鼠肾细胞培养，毒株在地鼠肾细胞适应到高滴度(10TCID50以上)进行接种，取培养上清，用福尔马林灭活。还可采用二次收液法，即病毒感染原代地鼠肾细胞后，换含小牛血清的199培养基，33℃培养6～7天第一次收液，同时加入相同的培养基，再维持4～6天第二次收液，用1:4 000福尔马林灭活。

  用截留相对分子量10万的超滤膜堆滤器浓缩一次收获火活病毒液。二次收获的灭活病毒液用0.l～0.5 mol/L乙酸锌沉淀，沉淀物用EDTA溶解，离心，超滤浓缩。以后有3条层析工艺路线可供选择：

  ①亲和层析   用pH7.2  1/75 mol/L PB平衡Cellufine Sulfate Gel柱层析，浓缩灭活病毒液上柱后，分别用pH8.0  1/75 mol/L PB，pH7.2 1/75 mol/L PB(含0.5mol/L、1.5mol/L和3.0mol/L NaCl)缓冲液分段洗脱，收集各蛋白质峰。或用3种pH值(pH6.5、pH6.8、pH7.0)的0.01 mol/L PB平衡柱，浓缩灭活病毒液上柱后，分别用PH8.0  0.01mol/L PB,0.5 mol/L NaCl，1 mol/L NaCl和3 mol/L NaCl洗脱，分部收集并台并ELISA法检测样品抗原阳性峰，得到疫苗原液。

  ②离子交换层析   pH7.2 0.02 mol/L PB平衡DEAE Sepharose-FF柱。浓缩灭活病毒液上柱后，用含0.3 mol/L NaCI和3 mol/L NaCl的相同缓冲液分段洗脱，分部收集并合并EIJSA法检测样品抗原阳性峰．得到疫苗原液。

  ③凝胶过滤层析   a、用pH7.4  0.02 mol/L PBS平衡Sepharose-4FF柱，浓缩灭活病毒液上柱后，用相同缓冲液洗脱，出现两个洗脱峰。一般第一峰为抗原峰，这种方法常用于一次收获灭活病毒液的纯化；b、乙酸锌沉淀柱层析，这种方法适合于二次收获灭活病毒液纯化，去除牛血清成分非常有效。这两种方法纯化的疫苗，其抗原量高，牛血清蛋白残余量小于10～42 ng/ml。毒类疫苗的生产工艺

 

一、甲型肝炎减毒活疫苗

  甲型肝炎的病原体是甲型肝炎病毒(hepatitis A vlrius，HAV)，1978年用感染HAV绒猴肝内复制的病毒经纯化、灭活后制成试验灭活甲型肝炎疫苗(inactivated hepatitis A vaccine )，简称甲肝疫苗，绒猴试验证明有保护作用。1979年在细胞培养中分离、培养成功HAV。野毒株在细胞培养中生长困难，驯化毒株繁殖缓慢且病毒滴度低，不引起细胞病变，成熟颗粒不释放到培养液中。20世纪80年代后期我国毛江森等研制成甲型肝炎减毒活疫苗，该疫苗生产中未经纯化加工。同时国外使用细胞培养来源的病毒材料研制了纯化的灭活甲肝疫苗，如史克必成的贺福立适(Hvarix)和默沙东的vaqta等。灭活甲肝疫苗由15S和70s两种颗粒组成，前者是完整的病毒体，后者则为自然的空心壳体，二者抗原性一致，空心颗粒是灭活疫苗中免疫原性物质的主要成分。20世纪末21世纪初国内也有科兴公司和医学生物所在开发纯化的灭活甲肝疫苗，前者已投入市场。

  纯化甲肝疫苗的生产工艺基本相似。通过细胞培养、接种已经过连续传代的HAV适应株毒种，进一步培养扩增病毒，收获细胞释放病毒颗粒。经过超滤、离子交换层析或分级离心等纯化加工，以甲醛灭括，制成疫苗原液。进一步加工可包括吸附佐剂等。

  制备甲肝疫苗所用的毒株均为在细胞培养中连续传代过的HAV适应株，CR326、HMl75、GBM、KRM003及CLF等。所用细胞多为传代细胞，如人二倍体细胞MRC-5、HEL，人胚肾细胞HEK，恒河猴胚肾细胞FRhK等，亦有使用非洲绿猴肾原代细胞的情况。

  史克必成的贺福立适甲肝疫苗采用HMl75株毒种，接种MRC-5细胞，培养后裂解以细胞收获病毒。病毒收获液经过除菌过滤，再通过超滤和柱层析工艺浓缩和提纯HAV。向纯化病毒里加入终浓度为250 μg/ml的甲醛，于37℃条件下灭活15天。灭活后的纯化病毒吸附Al(OH)3佐剂，加人终浓度为5 mg/ml的苯氧基乙醇(phenoxyethanol)作为防腐剂，按酶标法检测活性单位(Eu)稀释配制成720 Eu/ml和1440 Eu/ml两种浓度，每剂分装为360 Eu/0.5ml和720 Eu/0.5ml两种规格的成品。

  默沙东的Vaqta甲肝疫苗所用生产毒种是CR326F株，也采用MRC-5株人二倍体细胞培养，收获后先以有机溶剂萃取，再用聚乙二醇沉淀方法浓缩萃取物，浓缩产物经柱层析纯化，加人终浓度为100 μg/ml的甲醛，置37℃条件下灭活20天。已灭活后纯化病毒吸附Al(OH)3佐剂，不加任何防腐剂，按厂家自定义的标准单位(u)稀释配制成50 u/ml浓度，每荆分装为25 u/0 5 ml和50 u/ml两种规格的成品。

 

二、脊髓灰质炎减毒活疫苗

1．简介   

  脊髓灰质炎是由脊髓灰质炎病毒(polio virus)侵蚀中枢神经系统引起的、传播广泛且危害极大的急性传染病，脊髓灰质炎病毒造成脊髓前角灰白质区尤其是灰质区的特异性病变，临床上引起肢体肌肉松弛性麻痹，多发生于小儿。1909年发现脊髓灰质炎病毒后的40年中，疫苗研究进展缓慢，至该病毒能在非神经组织细胞中培养后，疫苗研制速度加快。1952～1953年Salk用猴睾丸或肾组织培养3个型的病毒获得成功，后制成灭活疫苗。随后Sabin研制成功碱毒活疫苗。国外现有纯化灭活脊髓灰质炎疫苗(inactivated polio vaccine，IPV)注射剂。我国现生产人二倍体细胞减毒活疫苗(固体糖丸剂型)和猴肾细胞脊髓灰质炎减毒活疫苗(液体剂型)两种口服疫苗(oral polio vaccine，OPV)，未经过纯化加工，均为三价疫苗。

2．生产工艺

  纯化的灭活脊髓灰质炎注射疫苗的生产毒种都为有毒株，Ⅰ型有Mahoney和Brunenders株，Ⅱ、Ⅲ型为MEF-l株和Saukett株。所用细胞多为Vero细胞，也有用MRC-5细胞者。

用微载体珠在各个l000 L培养罐中扩增基质细胞数目约为1.5×1012个/罐，每罐接种一型生产毒种，37℃培养3～4天，病毒复制过程中裂解细胞释放到培养液里。收获培养上清液，用0.2μm滤膜过滤澄清处理，超滤浓缩500倍至2 L，用柱层析技术去除细胞杂蛋白和DNA等杂质，获得1 5 L纯化病毒悬液。除菌过滤后加入1:4000甲醛，37℃灭活6天，过滤除去聚合团块。配型调整三型比例后分装为成品。

国内医科院医学生物所也进行了纯化脊髓灰质炎疫苗生产工艺的研究。其呲毒种接种单层Vero细胞，33℃培养30～48 h后收获病毒液。用0 6 μm和0.9μm孔径的筒式滤器串联过滤澄清病毒液。用1 0万分子量孔径PTHK滤膜超滤器将澄清病毒液浓缩100～200倍，病毒滴度增大，感染性回收率为85.6％。以具有分子筛和离子交换双重功能的Q-SepharoseFF凝胶柱对病毒浓缩液进一步层析纯化，层析柱先用40 mmo/L的PBS(PH=7)漂洗，病毒浓缩液上柱后，分别用40 mmol/L。的PBS(pH=7)和l mmol/L的NaCI洗脱，分部收集病毒富集峰，此步病毒感染性回收率可达100％，Vero细胞残留DNA可被除去。

 

三、流行性感冒疫苗

1．简介

  流行性感冒是由流感病毒(influenza virus)引发的急性呼吸道传染病。根据核蛋白（NP）和基质蛋白（M）免疫原性不同可将流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，甲型流感病毒是引起人类流感在全球流行的最重要的病原体，乙型流感病毒一般呈局部流行或小流行，丙型流感病毒仅引起散发流行。流感病毒毒粒表面有3种结构蛋白质，即HA(血凝素)、NA(神经氨酸酶)和M2，甲型流感病毒根据HA和NA免疫原性的不同，分为若干亚型（乙型、丙型流感病毒至今未发现亚型），目前已鉴定出15个HA亚型（H1～H15），9个NA亚型（N1～N9）。甲型流感病毒容易发生变异，主要是HA和NA的免疫原性易发生变异，HA变异最快，自20世纪以来，在人类流行的只有H1、H2、H3和N1、N2几个亚型。1937年鸡胚培养流感病毒获得成功，l941年早期粗制流感灭活疫苗问世，以后有冷适应株减毒活疫苗应用。现今流行性感冒疫苗(influenza vaccine)主要有3类，即灭活全病毒颗粒悬液疫苗、以物化方法部分或全部裂解病毒颗粒的裂解疫苗及主要由HA和NA抗原制成的亚单位疫苗，其中灭活疫苗是当前最常用的流感病毒疫苗。

2．生产工艺

  因流感病毒易发生抗原变异，世界卫生组织(WHO)发起每年进行流感病毒全球范围监测并发布当年和预测来年流行毒株。我国流感中心据此提供相似株供每年生产使用。WHO流感疫苗规程提倡生产含有至少一种或一种以上甲型病毒、一种乙型病毒株的多价流感疫苗(一般为三价)。毒株均用鸡胚胎培养。

  早期粗制流感灭活疫苗是用含流感毒粒的鸡胚胎尿囊液，进行红细胞吸附和释放的有月纯化，以甲醛灭活制戒，接种后局部和全身反应很强。后采用超速离心和层析技术提纯获得纯度提高的全毒粒疫苗，但儿童使用仍可出现不良反应。以3-N-丁基磷酸盐、聚山梨酸80酯、脱氧胆酸盐、Triton X--100和Triton N-101等裂解毒粒制成的裂解苗使不良反应大为降低。

  某灭活流感疫苗工艺流程是将病毒毒种稀释后，接种于无特殊病原体的9～10日龄鸡胚胎尿囊腔中，32～34℃培养48～80 h，收取高滴度的尿囊液和羊水，合并单价病毒收获液。各单价流感病毒收获液以蔗糖为介质进行速率区带超速离心纯化毒粒。所用蔗糖梯度液浓度为30％～55％，25000 r/min，15℃离心8 h后，分步收集合并HA高滴度峰，此过程可去除尿囊液和羊水大部杂质成分并浓缩毒粒。按1:600O比例加入β-丙烯内酯作为灭活剂，20℃灭活72 h。用超滤技术脱去蔗糖，经除菌过滤配型后分装为成品。除β-丙烯内酯，甲醛也是常用的灭活剂。

  再以流感感裂解疫苗为例，将冻干病毒毒种稀释后，接种于无特殊病原体的9～10日龄鸡胚胎尿囊腔中，35℃培养48 h冷胚，收集合并尿囊液。以10000分子量的超滤膜滤器超滤浓缩后，经Sepharose 4FF凝胶柱层析纯化，分步收集毒粒富集液。按血凝效价l：25600稀释，加入终浓度1.0％的Triton X-100裂解90 min，再经蔗糖梯度超速离心纯化，分步收集血凝效价l:160以上的抗原峰。合并后超滤除掉蔗糖，稀释并配型。

  裂解疫苗和亚甲位疫苗虽可减少不良反，但免疫原性不如全毒粒疫苗，促使人们开展了各类佐剂的应用研究。

四、流行性乙型脑炎疫苗

1．简介

  流行性乙型脑炎(己脑)是由乙型脑炎病毒引起的人畜共患中枢神经系统传染病，该病毒首先由日本学者于1935年从脑炎死亡者脑组织中分离得到，故国际上又称为日本脑炎病毒。病毒的抗原性由三种结构蛋白和非结构蛋白构成。80世纪30～40年代日本、美国制备了鼠脑灭活疫苗，1946年Warren和Koproski等制成鸡胚灭活疫苗，但使用效果并不满意。我国现有两种乙脑疫苗，是用P3株和SAl4-14-2株乙脑病毒毒种接种原代地鼠肾细胞培养制备的灭活疫苗和减毒活疫苗，并与国外同步研制纯化乙型脑炎疫苗(japanese encephalitis vaccine inactived)。

2．生产工艺

  日本生广鼠脑提纯乙脑灭活疫苗过去使用中山(Nakayama)株，1989年起改用北京l(Bejing 1)株，即P1株，在小白鼠脑中培养。我同开发中的vero细胞(非洲绿猴肾细胞)乙脑疫苗采用P3株，国外有用SA14-14-2株研制纯化乙脑疫苗的。

  鼠脑提纯乙脑灭活疫苗生产工艺是将P1株毒种接种小白鼠脑腔，待小白鼠出现典型发病症状后，收取鼠脑组织，脑组织经过匀浆和澄清处理后，加入鱼精蛋白用以除去核酸，加入终浓度为O.6％的甲醛4℃冷灭活50～60天，超滤浓缩，用饱和(NH4)2SO4沉淀，3000 r/min离心50 min后弃沉淀，上清液用40%的蔗糖垫进行超速区带离心，19000 r/min离心13 h，收集纯化病毒。以磷酸盐缓冲液透析除糖，加人终浓度分别为0.009％、0.0005％的硫柳汞和吐温-80，除菌过滤，冻于为成品。

  Vero细胞纯化乙脑疫苗制造所使用毒种是P3株病毒，以Vero细胞为基质，可用15 L转瓶、5 L或50 L微载体生物反应器培养，毒种接种Vero细胞培养3天后开始收获病毒，每2天收获1次，可收获4～5次。病毒收获液先用甲醛灭活，过滤澄清后再用超滤技术浓缩10～20倍，用硫酸鱼精蛋白处理，去除残余DNA，得到粗制纯化产物。进一步精制提纯有两条技术路线：①蔗糖速率区带超速离心法。采用日立58-P-72D型超速离心机，配以RPZ-35T区带转头，以36％～60％蔗糖为介质，对粗制纯化产物进行速率区带超速离心分离，以23000 r/min转速离心4 h后，收集位于38％浓度蔗糖区带的病毒，超滤除糖后除菌过滤得到纯化乙脑疫苗原液。②凝胶层析法。使用全自动凝胶层析系统，将粗制纯化产物通过Sepharose CL-6B凝胶层析柱去除大部分杂蛋白，超滤浓缩，再用装填Sephacryl S-500HR介质的层析柱去除大于病毒的杂质和残留的小分子杂蛋白，除菌过滤后即为纯化乙脑疫苗原液。疫苗原液中加入保护剂分装冻干制备出成品。

 

五、狂犬疫苗

1．简介

  狂凡病是由狂犬病毒引起人兽共患疾病。国外早期的狂犬病疫苗(rabies vaccine)为神经组织培养疫苗。20世纪60年代始用细胞为基质制各疫苗，主要有人二倍体细胞疫苗(HDCV)、原代地鼠肾细胞狂犬病疫苗(PHKCV)、精制鸡胚细胞狂犬病疫苗(PCECV)和提纯的Vero细胞狂犬病疫苗(PVRV)等。我国早期生产羊脑制备的经石炭酸灭活的疫苗(也曾制备乙醚火活疫苗)，1980年开始应用组织培养法制造纯化狂犬病疫苗（rabies purified vaccine），现有原代地鼠肾细胞狂犬病疫苗和Vero细胞狂犬病纯化疫苗。

2．生产工艺

 （1）几种代表性狂犬病疫苗生产工艺

  ①人二倍体细胞疫苗(HDCV)   这种疫苗为美国Wistar研究所首创，用人二倍体细胞WI-38株适应和培养病毒。用磷酸丁三酯灭活病毒，过滤浓缩后制备疫苗。以后由法国Meieux研究所用MRC--5人二倍体细胞培养病毒，用l:4 000β-丙烯内酯灭活病毒，浓缩后制成冻干疫苗。这种疫苗人体接种观察后证明接种后副反应轻，免疫效果好，目前公认可以作为新发展疫苗的标准对照疫苗。 

  ② 原代地鼠肾细胞狂犬病疫苗(PHKCV)   前苏联用Vnukovo-32株毒种在原代地鼠肾细胞(PHKC)培养，用第33代～第178代病毒制备成主毒种和生产用毒种。感染细胞培养液经紫外光照射灭活后制成两种灭活疫苗，一种是未经浓缩纯化的原制疫苗，一种是经浓缩纯化的疫苗。PHKCV注射后的副反应轻。

  ③提纯的Vero细胞狂犬病疫苗(PVRV)   法国Memux研究所于1985年研究成功Vero细胞培养生产的狂犬病疫苗。疫苗经超滤浓缩，蔗糖密度梯度离心纯化，β-丙烯内酯灭活制成冻干疫苗。因伴随浓缩过程疫苗的异源小牛血清蛋白相应增加，导致不良反应的加重和增多。

  为了进一步减少纯化PVRV的副反应，Paster  Merieux Connaught厂新近又改用柱层析技术纯化疫苗，并在生产过程中将人白蛋自在加入β-丙烯内酯前去除掉，制成一种新的层析纯化Vero细胞生产狂犬病疫苗(CPRV)。这种疫苗经与现有的PVRV进行比较，副反应少同时又具有高免疫原性。

（2）主要纯化工艺

  大规模精制地鼠肾细胞和Vero细胞狂犬病纯化疫苗均以超滤法浓缩病毒培养液，然后采用层析和区带离心等技术纯化狂犬病毒。

  ①乙酸锌和Sepharose 4FF柱层析   狂犬病毒固定毒株接种基质细胞，培养后收获病毒培养液。所收获病毒培养液灭活后，用0.1～1.0 mol/L乙酸锌沉淀，弃上清液。乙酸锌沉淀后用EDTA溶液溶解，离心超滤浓缩即为柱层析料液，该料液经Sepharose 4FF柱层析，用紫外监测仪收集第一峰，可获得效价较高的病毒原液。稀释后加人佐剂和人血清白蛋白，制备成精制疫苗半成品。

  ②DEAE -Sepharose 4FF CL-6B离子交换层析   将浓缩的病毒原液100 ml，经0.01 mol/L pH7.2 PBS平衡柱透析两次后，选用介质DEAE-Sepharose CI-6B进行层析。上柱后分别用0.01 mol PB+0.15 mol NaCI、0 01 mol PB+0.03 mol NaCI及0.01 mol PB+0.05mol NaCI溶液洗脱，经紫外监测仪检测A280，分步收集蛋白质峰。取样后用ELISA法检测样品抗原活性，并将ELISA检测阳性样品合并，测定残余牛血清白蛋白含量、蛋白质含量和ELISA效价，并按最终含量加入0。6 mg/ml的Al(OH)3溶液和0.5％人白蛋白后进行效力试验和安全试验。

  ③Sephaery 1S-200 HR分子筛选层析法   将浓缩的病毒原液10 ml，经0.01 mol/L pH 7.2 PBS平衡柱透析两次后，选用介质Sephaery 1S-200 HR进行层析。上柱后分别用0.0l mol PBS+0.15 mol NaCl进行溶液洗脱，经紫外监测仪检测A280，分步收集蛋白质峰并进行各项检测。

  ④二次蔗糖等密度区带离心法   将病毒原液30倍浓缩后经1 000g离心20 min后取上清,按1/50加入pH 5.0，l mol Zn(Ac)2溶液，混匀后调至pH6.7～6.9，4℃放置20 min，1 000g离心40 min后取沉淀，TNE中4℃透析过夜，上述产物经第一次蔗糖等密度区带离心(梯度介质为10％～60％蔗糖溶液，50000g、l5 h)后分步收集弗进行各项检测。

这几种方法制成的地鼠肾细胞和Vero细胞狂犬病纯化疫苗,其效力、牛血清含量及安全试验等指标均符台WHO规程的要求。

 

六、肾综合征出血热原代地鼠肾细胞灭活疫苗

1．简介

  肾综合征出血热(epidemic haemorrhagic fever wlth renal syndrone，HFRS)是由布尼亚病毒科、汉坦病毒(Hantavirus，HV)属中的几种病毒引起的自然疫源性疾病，分布于亚、欧、非洲和美洲32个国家和地区。1978年李镐汪等首次分离到朝鲜出血热(KHF)病毒，1981年我国用非疫区黑线姬鼠及人肺癌传代细胞A549也分离到流行性出血热(EHF)病毒，将该病毒适应到VeroE--6细胞，为研制人用疫苗开创了新的前景。迄今国内外已初步研制出3类HFRS疫苗――肾综台征出血热原代地鼠肾细胞灭活疫苗(haemorrhagic fever wlth renal syndrome vaccine)，即纯化鼠脑灭活疫苗、两种细胞(地鼠肾细胞及沙鼠肾细胞)和基因工程重组痘苗载体活疫苗。

2．生产工艺

 （1）乳鼠脑肾综合征出血热纯化疫苗

  国内I型肾综合征出血热纯化疫苗生产采用LR1株毒种，接种1～3日龄乳鼠脑。选择6～9日龄发病典型的乳鼠，无菌取脑组织，经反复冻融使病毒充分释放。加磷酸缓冲液制成病毒悬液。低速离心后取上清液，加入适量鱼精蛋白，再低速离心后取上清被，加入1:4 000 的β-丙内酯于4℃灭活2天。以蔗糖速率区带离心法离心，分部收取糖膜蛋白G1、G2和核壳蛋白NP 。经凝胶层析脱糖纯化和除菌过滤后即为原液，以后加人防腐剂、稳定剂和佐剂分装出成品。

 （2）地鼠肾细胞肾综合征出血热灭活痘苗

  采用地鼠肾细胞培养，毒株在地鼠肾细胞适应到高滴度(10TCID50以上)进行接种，取培养上清，用福尔马林灭活。还可采用二次收液法，即病毒感染原代地鼠肾细胞后，换含小牛血清的199培养基，33℃培养6～7天第一次收液，同时加入相同的培养基，再维持4～6天第二次收液，用1:4 000福尔马林灭活。

  用截留相对分子量10万的超滤膜堆滤器浓缩一次收获火活病毒液。二次收获的灭活病毒液用0.l～0.5 mol/L乙酸锌沉淀，沉淀物用EDTA溶解，离心，超滤浓缩。以后有3条层析工艺路线可供选择：

  ①亲和层析   用pH7.2  1/75 mol/L PB平衡Cellufine Sulfate Gel柱层析，浓缩灭活病毒液上柱后，分别用pH8.0  1/75 mol/L PB，pH7.2 1/75 mol/L PB(含0.5mol/L、1.5mol/L和3.0mol/L NaCl)缓冲液分段洗脱，收集各蛋白质峰。或用3种pH值(pH6.5、pH6.8、pH7.0)的0.01 mol/L PB平衡柱，浓缩灭活病毒液上柱后，分别用PH8.0  0.01mol/L PB,0.5 mol/L NaCl，1 mol/L NaCl和3 mol/L NaCl洗脱，分部收集并台并ELISA法检测样品抗原阳性峰，得到疫苗原液。

  ②离子交换层析   pH7.2 0.02 mol/L PB平衡DEAE Sepharose-FF柱。浓缩灭活病毒液上柱后，用含0.3 mol/L NaCI和3 mol/L NaCl的相同缓冲液分段洗脱，分部收集并合并EIJSA法检测样品抗原阳性峰．得到疫苗原液。

  ③凝胶过滤层析   a、用pH7.4  0.02 mol/L PBS平衡Sepharose-4FF柱，浓缩灭活病毒液上柱后，用相同缓冲液洗脱，出现两个洗脱峰。一般第一峰为抗原峰，这种方法常用于一次收获灭活病毒液的纯化；b、乙酸锌沉淀柱层析，这种方法适合于二次收获灭活病毒液纯化，去除牛血清成分非常有效。这两种方法纯化的疫苗，其抗原量高，牛血清蛋白残余量小于10～42 ng/ml。